Timp de 16 ani a jucat pe scena teatrului "Radu Stanca" din Sibiu, după care s-a mutat la București, la teatrul "Lucia Sturza Bulandra".
Besoiu, care azi împlineşte 81 de ani, a devenit celebru după filmul "Toate pânzele sus" (1976), alte roluri consistente avându-le în pelicule ca "Neamul Șoimăreştilor", "Haiducii", "Răscoala", "Ion, blestemul pământului, blestemul iubirii", "Ultima noapte de dragoste", "Lumini și umbre".
În teatru, Besoiu s-a făcut remarcat în piese ca "Unchiul Vanea", "Hamlet", "Mizantropul", "Antigona" sau "Trei surori". În 2002, actorul a primit Premiul de excelență al Cinematografiei Române. În aprilie 2011, Consiliul Național pentru Studierea Arhivelor Securității (CNSAS) a cerut Curții de Apel București să constate calitatea de colaborator al fostei Securități a lui Ion Besoiu. Conform CNSAS, actorul a colaborat cu Securitatea, având numele conspirativ de "Bogdan".